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Sonderabdruok aus Hoppe-Seylor’s £tschr. f. physiolog. Chem. 288. Bd. (1948)

Zur Existenz des sogenannten „Vierten Stoffes“, der blutdrucksenkenden Substanz von Lange und Felix

Von

Heinrich Hellmann und Peter Witt

Aus dem Kaiser-Wilhelm-Institut für Biochemie und dem Pharmakologischen Institut

der Universität Tübingen

(Der Schriftleitung zugegangen am 3. Juli 1948)

Auf Grund seiner Studien über die Regulation des peripheren Kreislaufs schloß F. Lange¹ 1932 aüf das Vorhandensein einer blutdrucksenkenden Substanz, die nach ihrem pharmakologischen Verhalten mit keinem der bis dahin bekannten hypotensiven Stoffe — Histamin, Acetylcholin, Adenylsäure — identisch sein sollte: K. Felix und A. v. Putzer-Reybegg² hatten die Isolierung und Konstitutions-ermittluhg dieses sog. „vierten Stoffes“ in Angriff genommen. Als Aus-gangsmäterial dienten ihnen hauptsächlich wässerige, von Eiweiß und L’piden befreite Extrakte aus Gekröse. Aus den alkohollöslichen Anteilen dieser Mesenterialextrakte gewannen sie durch Anwendung der Methode zur Basentrennung von Kossel und Kutscher eine wirksame Fraktion, aus der sich ein Guanidinkörper in Form verschiedener Salze kristallisieren ließ. Aus den Analysen dieser Salze errechneten sie für den Stoff die Summenformel C₄H₁₂N₆. Da er eine positive Saka-gouchi-Reaktion lieferte und bei Behandlung mit Jodwasserstoff eine an Stickstoff gebundene Methylgruppe abspal[ete, vermuteten sie in dem wirksamen Stoff ein pionomethyliertes Metbylcn-diguanidin. Bemerkenswertwar die Säurestabilität; selbst 18-stdg. Kochen mit 30-proz.

¹ F. Lange, Münchener med. Wschr. 77, 2095 [1930]; Verh. dtsok. Ges. inn. Med. 44, 106 [1932]; Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 164, 417 [1932]: Rlin. Wschr. 12, 173 [1933]; — W. Ehrlich u. A. E. Cohn. J. exp. Med. 52, 65 [1930].

* K. Felix, Klin. Waphr. 12, 176 [1933]; — u. A. v. Putzer-Reybegg, Klin.Wschr.il, 1838 [1932]; Münohener med. Wschr. 77, 2097 [1930]; Verh. dtsch. Ges. inn. Med. 44, 109 [1932]; Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 164, 402 [1932].

202

H. Hell mann und P. W iinf

Bd. 283.(1948)

Schwefelsäure führte zu keinem Wirksaiu1^g|tsVerlust: Nach vorheriger Desaminierung Wurde mit 2,5 bis- 7 fe^^^Èristallisajö; an der atropini-sierten Katze noch eine deutliche Senkung’ ^^ffluM^ckes erziel^H Über die endgültige Konstitutiöiisermittlung des. fraglichen Stoffes finden sich im Schrifttum keine weiterèü Angaben; Von^anderer Seite wurden in der Zwischenzeit neue blutdrucksenkende ^:StJffe“ entdeckt, das Kallikrein tmd die „Substanz P“³. Mandienn^bis heute von beiden nicht die Zusammensetzung; dardie;^^^ aber^^eder kochbeständig noch alkohollöslich und die zweite nicht^anrestabil^^^können sie mit dem sog. „vierten Stoff“ von Lar g^ind»^lix- nicht identisch sein. Andererseits sind die Arbeiten von Länge und Felix nicht unwidersprochen gebheben. Gaddu^und Schild⁴ konnten in Darmextrakten außer Histamin keinen anderen säurestalË^^ an der a^ninisierten Katze blutdrucksenkend wirkenden Stoff ^uffinden. Gaddum⁵ sprach sich dafür auä, daß’Felix’und v. Pu₍tz»M’^R,^re.^^gg He^iylguanidin-salze kristallisiert hätten, ‘denen eine kleine Menge Histamin^^^emengt War. Histamin soll sich möghcheEWeise beim Nochenppc^arker Säure aus Histidin gebildet haben.

Auf Vorschlag von Hrn. Prof. F. Lange. und im Einvernehmen mit Hrn. Prof. Felix haben wir uns vS©iV<M^    “Pro

blem beschäftigt; wir,teilen im folgenden die Ergebnisse unserer Experimente mit.

Zur Natur des von Felix und ^:Putzër-Reybëgg dar gestellten K r y s t ä klSaa, t e

Felix und v. Putzer-Reybegg/”haben selbst darai^EM^eWiesen. daß die Analysenzahlen ihres Kristallisates.auf Methylguanidin.^tim-men; sie verwarfen jedoch die Möghchkeif einer Identität dës Methylguanidin mit ihrem Stoff, da „dessen Pikrat und Goldsalz ganz* andere Eigenschaften besitzen, ganz abgesehen davon, daß fMethylguanidin den Blutdruck nicht senkt, sondern steigert“⁶. Die Sm^elzpunktë dër von ihnen kristalhsierten Salze sind folgende:

Flavianat 231°, Chloraupaft 204?, ^ ^ Pikrafil 197°.

I.    ._    ■    ■

Wir haben die entsprechenden Salze des Methylguanidins/her-gestellt und für sie folgende Schmelzpunkte gefunden;? 7

Methylguanidin-Flavianat 230,5°, -Chloraurat 204°, -Pikrat 197,5°.

³ Vgl. Gaddum u. Dale, Gefäßerweiternde Stoffe der fâëwébn^;»Leipzig 1936, S. 97 u. 102.    •_: ‘”. ‘■’    .

* Gaddum u. Schild, J. Physiology 83, 1 [1934]. –

⁵    Gaddum u. Dale, Gefäßerweiternde Stoffe*aer|,Gewebe^Leipzig 1936, S 98; vgl. auch Guggenheim, Biogene Amin , Basel 1940.

⁶    K. Felix, Klin. Wschr. 12, 177 £193’3]:

Bd. 283 (1918)

Existenz des „Vierten Stoffes“

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Die Kristallformen der von uns hergestellten Salze gleichen den von Felix und v. Dutzer^Reybegg veröfféntlichten Kristallbildem⁷auffallend. liegt daher in $er Tat der von Gaddum gezogene Schluß sehr nahe, daß diese Autoren in ihren Kristallisaten nur Salze des Methylgüanidins in Händen hatten. Die beschriebene Wirkung muß dann auf Verunreinigung zurückgehen; wir prüften selbst nochmals die Blutdruckwirkung des Methylguanidins an der Katze und» können bestätigen, daß dër reine Stoff keinerlei senkenden Einfluß hat A

Unters ü c h ü A g der blutdrucksenkenden Wirkung > von Me|;fentërialextrakt

?^Ë|^ërblieb ßomit die Aufgabe, erneut n^ch^der Ursache der senkenden Wirkung der- Mesenterjalextrakte zu forschen. Diese Aufgabe Stellte .sich praktisch so dar, daß ein alkohoUöshcheÉ:^äurestabiler Stoff gesucht werden mußte, der nach Desaminierung noch eine Wirksamkeit an der atrqpinisierten Katze besitzt; denn Kallikrein scheidet durch ^^a^iUnlöslichkeit in Alkohol aus, Adenylsäure, Adenosin und Substanz. P durch Verlust ihrer Wirksamkeit beim Kochen, mit Säurp, ^Histamin durch Desaminierung, Acetylcholin bzw. Gholin durch Ver-f^endung^^Patropimsiër|èm Katze als TesttierJfphser Aufarbeitungsgang, der die genannten Tatsachen berücksichtigt, war der folgende: Von Fett uhd;FrfemdgéWebe mechanisch befreites Schweinemesen-^terium wurde im Mpisbliw’olf zerkleinert und mit essigsaurem Wasser yöm.pB; 4,0 20^Min. ausgekocht. Die heiße Brühe wurde filtriert und , mit iagpijj Filtrat jfë|ä|E|’^Ürichloressigsäurefällung ziir Entfernung der Ei-_:wtéißstoffe durehgeführt. Überschüssige Trichloressigsäure sowie Lipide wurden durch Ätherexträktion beseitigt. Der Rückstand, des nunmehr lipid- und”,eiweißfreien wässerigen Mesenterialextraktes wurde zweimal mit Alkohol ausgezogen. Der Trockeniückstand des alkoholischen Extraktes WUrdè in Wässer auf genommen und mit Natriumnitrit und Essig-desämihiert. Zur Entfernung überschüssiger salpetriger Säure und zur Zerstörung ev. noch vorhandener Adenylsäure und Adenosin ^ wurde 1 Stdè. in 5-proz..schwefelsaurer Lösung auf dem Wasserbad v unter verminäprtem Druck erhitzt. Nach Neutralisation mit Soda erfolgte Verdampfen %fes Wassers und Durchrühren des Rückstandes mit ‘ Alkohol, wobei ari^fgânische: Salze ungelöst blieben. Der Troekenrück-stand dieser. letzten Alkohqlextraktion wurde in physiolog. Kochsalzlösung aufgenommfen und an der atropinisierten Katze getestet. Zur

?-K. Eélix n. A. v. Putze j- Reybe.gg, Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol, u. Pharmakol. 169, 214 [1933:]

Prof. Felix teilte uns freundlicherweise mit, daß er selbst schon früher . Zur gleichen Auffassung gelangt.s’ei und darüber 1934 auf der Physiologentagüng ‘ in G’öttihgén und 1936 auf einer Tagung in Oeynhausen vorgetragen habe. Leider sind;Mié|ë. Befunde nicht ins Schrifttum übergegangen.

204    H.    Hellmann    und    P.    Witt    Bd.    283    (1948)

Sicherung wurden weitere Teste am isQlieftéii Fros^hherzen und am isolierten Meerschweinchendarm durchgeführt. Die Resijltate der phär* makologischen Prüfungen, die im Versuchsteil’ i^per beschrieben sind, zeigen, daß in unserem Vërsuch im Schweine)Mesenterium und -Darm außer Histamin und Cholin kein andefer^äurestahiler alkohollöslicher depressorischer Stoff gefunden worden isfc.

F. L a n g e beschrieb als Charakteristikum des „vierten Stoffes*‘ eine bei der Blutdrueksenküng gleichzeitig auf tretende Âmphtudenvergi^èy rung und die Eigenschaft, daß durch größte Dosen bei’Senkung dès Blutdruckes auf tiefste vGrade niemäp| eine tödliche Wirkung “eintrat ^’durch Atropin wurde die Wirkung seiner gereinigten Präparate nicht beeinflußt⁹. Wir haben bei unseren Aufarbeitungen niemals eine Solche Amplitudenvergrößerung beobachtet. Diese,, Diskrepanz, bedarf einer Klärung, um so mehr, als R. Christie¹⁰ aus eipem Tumor des Glomus caroticum eines Menschen und aus den Glomera von Haifischen und Rochen, eine blutdrucksenkende ^Substanz ameiéhhr|^’ die sich -von Acetylcholin, Histamin, Adenylsäure und Kallikrein untersc^èd. Die Befunde in bezug auf den Tumor des menschlichen Glomus caroticum wurden kürzlich bestätigt¹¹.

Den HHrn. Prof; A. Butenahdt, Prof. F. Haffner und Prof. F. Lang e danken wir für ihr förderndes Interesse an der vorliegenden Arbeit.

Beschreibung der Versuche

Der im folgenden gegebene Bericht stellt eine Zusammenfassung aus den Protokollen von insgesamt 27 Aufarbeitungen dar, die wir im Laufe eines Jahres -durchführten. •

Herstellungder Mesenteri’aljextrakte.ⁱ1450,g-öeHä,chtf5®cheh Sei«!-.,” nemesenteriums wurden , von Fett und anhaftendem Fremdge^ejbe befreit und durch einen Fleisehwolf getrieben.-Das zerkleinerte Gewebe (720, gj): würde nach Verrühren mit 1,5 l Essigwasser vom Ts. 4,0 20 ln. gekocht. Der wässerige essigsaure^–Extrakt ließ Sich in heißem Zustand sehnell filtrieren. Sobald ,er auf 60° C abgekühlt war,. wurde die Lösung? 1‘0-proz. trichloressigsauer ■”genmpht zwecks Ausfällung der gelösten Eiweißstoffe,. Jtfach Abfiltrieren der entstandenen Fällung und Eindampfen des Filträtbs konnte der verbliebene Rückstand durch dreimalige Extraktion”mit Äther von überschüssiger- Trieb loressugsanire und von Lipiden befreit werden. Der im Rückstand aufgesaugte Äther wurde abgedampft, -der lipid- und .eiweißfreie Trockenrückstand des wässerigen Mesenteriailextraktès’ zweimal mit Alkohol’ äusgezagen,,. der Alkohol verdampft, der Rückstand¹ der alkoholischen Lösung mit Wasser’verrührt und .’die’sich bildende Losung klar filtriert. Äthanol-Wasser-lösllché Fraktion. Sie enthielt in 30\écm Lösung^ 1,8 g orangefarbener Trockensubstanz. ^:

Desaminierung und Säurebehandlung. ’25 ccm der Alkohol-Wasserlöslichen Fraktion wurden mit l .g Natriumnitrit und. ^-acm ‘jEiseshig^er’sbföt und _% unter mehrfachem Schütteln 5 Stdn. stehen gelassen. Dann wurde die Lösung ,

⁹    F. Lange, Naunyn-Schmiedebergs Ärch. exp. Pathol. Pharmakoll| 164,

. 421 [1932], ;    –    •Y.Y..    .    ‘Éz&M –    •    v” ;

¹⁰    R. Christie, Endocrinology 1933, S. 421,. 433.

¹¹    L. Leger, J. L. Parrot u. P. Gley, Presse,méd. 1947, 542.

Existenz,,des „Vielten ‘Stoffes^4<

205

JBd. 283, (19#)

: 5-jjrQz    gemä cht und üntèr mehrfacher Zugabe von Wasser 1 Stde.

auf denn Wasserrad am Wasseistrahlpumpeoorvakuum erhitzt. Nach diesem Be-, ₍ iiandfei^^ptr Histamin durch Be4â^’inm:ung zerstört, Adenylsäure und Adeno-^m^’-aTen,;ge^c‘pai’teiiC H|pamirk wird ^w^dièsoA Bedingungen nicht au’s Histidin gebildet”^*^?ddüinMë|ntchü^ß’^n^^lc’he Hiswnunbildung bei Felix, dér eine ^ Pr nb^^^^Hbiftra lctèsTiÉI drding^ 130-proz. Schwefelsäure ohne Wirksam piffeÉétffystffil    fcri^cmvWir habèn uns von den

, aufgezahltcn Tatsachen dadurch uberzeugt/ daß wir jeweils Proben von Histamin, Adenylsaure, Adenosin und Histidin* derselben Behandlung mmtfeeiiogen. Nach Neutralisation mit Soda verdampften wir di^vI^Bfipg’izur Trockne, und nahmen in »Alkohol auf, ^,‘o^i; di’^-iidrganisehen-ungelöst blieben (etwas; Na’tieiüina,c’ét atjppg ,in Lösung|%illp|erursacht jedoch nach unserer Kontrolle an Kat^ë keine Blutdrubk^hkung)cNach Vertreiben des

stand in physio’k Kochsalz-Losung aufgenpmmen^’l®^^ruinierte Äthanol-W ä ss e r – jj^Hdhe Fr J||p|©n. ’ Sié ent hierin ₍^?|5»iii -Losung 1,0 g gelblicher fTrdekensubstanz. _

Außer Äthänolextraktionen habën. wir auch solche mit Butanol an Waseh-‘-wässern won’ ^in4erdä*è^h^’des’^i^^^^ ScÉl^la&höfe^

Ph a

1.    S, B Dm d r uckes a n äCrlnu r k © ti s i e r t ©n – Katze

nach Frank-Pitt^^^^^^mi^^mlefcp^^d, “as. vet. ^tänbten Katz©: Wurde |im|§    ‘idafe. Biutdruck^;fdiirch ein

iatarrës^HphréhS^stem, BBfcÉ^rfeni^É^^fe^É^iri-KocbMlzlffennigi -L Heparin.’ Saufe^    Xfir Verhinderung der – Blutgerinnung wurden der

-des”    mePrefeLcc-ni    ^ffipariiüNaCl–Lösung L v. inji- –

j^anider-wurden die’- T^pti _;■ BubstanzeSm l.^. injiziert, und (fwzei^yl.Sp^^j^talz-Lögting- zurbj^éimgimg

Wirkung, die <K^p^mini^^’^$3t$tanz in KonzenöSä^âE^pll^Hr^Hiit 0,-5/bzw. 1,0 ccm deutlich entfaltete, verschwand. näch Cfä^è^pÖa: 3^mg*A^opm; was_t der, Wirkung von Aéetylcholin bzw. Cholin-entsp|m||t;. • 10’%’ Acetylcholin bzw. ‘S mg Cholin zeigten den Jlllcheh- Effekt. 10 mg ‘Methylguanidin – zeigen è^^-geringël^lutdruck’stetgernde Wirkung (Kurve I,^– :• Js’. §eite;206).’.J

2. Unt e.r’siich ung äri de\: ^    éinittene.n Darnâr-s t ü cäc ëpH Ein 3’cm langes Darmstüpk’eines Meerschweinchens wird wärmerHyrode-Lösung an einer ^itenbefestigt, an der anderen mit einem 2eiger Verbunden. Auch! hier zeigte die desaminierte Fraktion einen durch Atropin auf heb- ^: bärén Effekt. Die Wirkung der.nichtdesaminierten Fraktion ließ sich durc^i-Atropin nicht vollständig-aufhebeii und glich der Wirkung Von Histamin 1:10 Ö0Ö000. Methylgiiâmdim zeigt$$-: 3Q00 einen geringen dtohisfërjMden Effekt (Kurve II).

_: 3. Prüfung.^»i^o 1 fëlr ten Frö_fschherzen nach Straub: Am isolierten mit, Ringerlösung gefüllten. FrösehherZen äh idrer Süraiibschen’ Kanüle bewirkte die’ hichtdesämihiertè Fraktion èirie Senkung der Hubhöhe, die sich durch Atropin aufhebp^’iihßv was der ‘Äs^^lcholhi^kiln^;’ entspricht. Die an den vorgenannten Präparaten außerdem gefundene, Histamin Wirkung der niehtdesa-miniei;ten Fraktionen, läßt, siclyam-Fröschherzeh nicht zeigen. Die Wirkung der desaminiCr^n^Fraktion 1 :.,3Ö wurde durch Atropin Verzögert rückgängig gemacht, was an unseren Präparaten,der Wirkung einer Cholfnlösung 1:100 entspricht. ..Die geringe Wirkung einer Methylgilanidinlösung 1:1000 wurde durch .Atropin nicht, beeinflußt (Kurve III).

.Näph diesen Versuchen ist die blutdrucksenkende Wirkung der geprüften ‘Extrakte -nicht’ von d©n bekannten Wirkungen von Histamin und Acetylcholin Unterschieden bzw. ist die abgëschwäehtè. Wirkung naoh Desaminierung auf Cholin zurückzufübren. .

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G èo rg^lf chmidu | ®

Bd. 283 (1948),

Ausgewählte Beispiele der Wirkung der/desamihierten Substanz im ’Vergleichs-nut Aeetylcholin, Cholin und niéhtdesaminiertér. .Substanz.

I: Blutdruck (Katze), II: Darm (Meerschweinchen), III: Herz (Frosch).